主要用途

细胞 TUNEL 比色法定量检测试剂是一种旨在使用标准化的化学方法， 包括固着、封阻、通透等 完整步骤， 从培养细胞中探寻 DNA 断点， 即运用修饰过的核苷酸， 在末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)的 帮助下，对 DNA 单链或双链上断点处的 3’末端进行标记，通过染料四甲基联苯胺染色显示蓝色，即通过 比色法定量分析单细胞水平的 DNA 降解状况的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、 成功实验证明的。主要适用于各种人体、动物、植物等培养细胞的 DNA  降解测定。广泛用于细胞凋亡的 研究。产品严格无菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定。

技术背景

细胞凋亡， 或细胞程序性死亡，在诸如形态发育、免疫系统调节、以及肿瘤和神经退行性疾病等各种生物 学过程中， 起着实质性的作用。凋亡细胞具有形态、生化、和分子方面的显著特征。其中内源性核酸酶的 激活，将 DNA 链在核小体间连接区切成缺口，使核内DNA 断裂成小片断。在组织细胞原位 DNA 切口处 可被末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)标记上生物素 dUTP，即 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling)，然后通过与过氧化物酶缀合卵白素(Peroxidase conjugated avidin) 的反应， 由四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine ，TMB) 作用显示蓝色， 产生吸光峰值的变化(650nm 波长)，来定量分析 DNA 降解状况。四甲基联苯胺是过氧化物酶(Peroxidase) 的生色底物， 在过氧化物酶 的催化下， 电子供体 TMB 底物在过氧化氢氧化下失去电子， 产生游离自由阳离子单电子氧化产物， 在 pH4.9 条件下，呈现出颜色变化和沉积， 形成蓝色沉淀产物，且不受乙醇影响。被用于检测标记过氧化物酶的活 性，灵敏度高，特异性好。

用户自备

96 孔细胞培养板：用于细胞培养的容器

培养箱：用于细胞染色孵育

酶标仪：用于比色分析

特别注意

1 ．酶标液(Reagent E) 不能在室温下冻融， 而必须在冰槽里冻融， 冻融后即刻使用； 严禁反 复冻融；考虑分装， 以备下次使用

2 ．每次移取试剂，须更换枪头，以免污染母液，影响结果

实验步骤

一、细胞预处理

1 ．准备 1 个 96 孔细胞培养板的待测细胞(2 X 104 细胞)

1 ．小心抽去细胞培养液

2 ．小心加入XXX微升清理液(Reagent A)

3 ．小心抽去 清理液(Reagent A)

4 ．小心加入XXX微升固着液(Reagent B)

5 ．室温下孵育 30 分钟

6 ．小心抽去 固着液(Reagent B)

7 ．小心加入XXX微升清理液(Reagent A)

8 ．小心抽去 清理液(Reagent A)

9 ．小心加入XXX微升封阻液(Reagent C)

10．室温下孵育 30 分钟

11．小心抽去 封阻液(Reagent C)

12．小心加入XXX微升清理液(Reagent A)

13．小心抽去 清理液(Reagent A)

14．小心加入XXX微升通透液(Reagent D)

15．置于冰槽里，孵育 3 分钟

16．小心抽去 通透液(Reagent D)

17．小心加入XXX微升清理液(Reagent A)

18．小心抽去 清理液(Reagent A)

二、 断点标记处理

1．小心加入XXX微升酶标液(Reagent E)

2．在 37℃湿润的培养箱里，孵育 1 小时，保持湿润，避免干枯

3．小心抽去 酶标液(Reagent E)

19．小心加入XXX微升 清理液(Reagent A)

1．小心抽去清理液(Reagent A)

三、比色测定

1．小心加入XXX微升染色液(Reagent F)

2．室温下孵育30 分钟，避免光照

3．小心抽去 染色液(Reagent F)

4．小心加入XXX微升清理液(Reagent A)

5．小心抽去 清理液(Reagent A)

6．重复实验步 4 至 5 二次

7．小心加入XXX微升的 显色液(Reagent G)

8．室温下孵育 30 分钟，避免光照(注意： 可见蓝色沉淀)

9．即刻放进酶标仪测读：波长 650nm

10．构建细胞 DNA 降解曲线： 纵座标(Y 轴) 为吸光值(OD)；横坐标(X 轴) 为时间点或药物处理浓度 等

注意事项

1．本产品为 20 次操作

2．操作时，须戴手套

3．封阻液(Reagent C) 达到 100％封闭效果，超过双氧水封闭效果

4．本产品为生物素标记，超过荧光素标记强度 1000 倍

5．酶标液(Reagent E) 严禁反复冻融

6．所有操作在室温下进行，除操作中规定之外

7．每次更换试剂溶液时，保持样品表面基本晾干

8．试剂溶液在样品表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满样品表面

9．如果用户没有 650nm 的滤波器，可以使用 630 至 650 之间的任一波长

10．建议细胞染色完成后，即刻进行比色分析

11．本公司提供系列细胞凋亡试剂产品

质量标准

1 ．本产品经鉴定性能稳定

2 ．本产品经鉴定检测敏感

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK ，  RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。